Пятница, 23 февраля, 2024
ДомойБиологияМассачусетский технологический институт совершает революцию в области клеточной визуализации: новый способ увидеть...

Массачусетский технологический институт совершает революцию в области клеточной визуализации: новый способ увидеть активность внутри живой клетки

- Advertisement -

Исследователи Массачусетского технологического института разработали метод, который позволяет им наблюдать до семи различных молекул одновременно, а потенциально даже больше.

Используя флуоресцентные этикетки, которые включаются и выключаются, Массачусетский технологический институт инженеры могут изучить, как взаимодействуют молекулы в клетке, чтобы контролировать поведение клетки.

Живые клетки бомбардируются множеством видов поступающих молекулярных сигналов, которые влияют на их поведение. Возможность измерить эти сигналы и то, как клетки реагируют на них через нижестоящие молекулярные сигнальные сети, может помочь ученым узнать гораздо больше о том, как работают клетки, в том числе о том, что происходит с ними по мере их старения или заболеваний.

В настоящее время такого рода комплексное исследование невозможно, поскольку современные методы визуализации клеток ограничены лишь несколькими различными типами молекул внутри клетки одновременно. Однако исследователи Массачусетского технологического института разработали альтернативный метод, который позволяет им наблюдать до семи различных молекул одновременно, а потенциально даже больше.

Прорыв в молекулярной визуализации

«В биологии есть много примеров, когда событие запускает длинный каскад событий, которые затем вызывают определенную клеточную функцию», — говорит Эдвард Бойден, профессор нейротехнологий Ю. Евы Тан. «Как это происходит? Возможно, это одна из фундаментальных проблем биологии, и поэтому мы задались вопросом, могли бы вы просто наблюдать, как это происходит?»

Новый подход использует зеленые или красные флуоресцентные молекулы, которые мерцают с разной скоростью. Путем визуализации клетки в течение нескольких секунд, минут или часов, а затем извлечения каждого из флуоресцентных сигналов с помощью вычислительного алгоритма можно отслеживать количество каждого целевого белка по мере его изменения с течением времени.

Используя четыре переключаемых флуорофора, исследователи из Массачусетского технологического института смогли пометить и отобразить четыре различных киназы внутри этих клеток (четыре верхних ряда). В нижнем ряду ядра клеток отмечены синим цветом. Фото: предоставлено исследователями

Бойден, который также является профессором биологической инженерии, наук о мозге и когнитивных науках в Массачусетском технологическом институте, исследователем Медицинского института Говарда Хьюза, а также членом Института исследований мозга Макговерна Массачусетского технологического института и Института Коха по интегративным исследованиям рака, а также соавтора директор Центра бионики К. Лизы Янг, является старшим автором исследования, которое было опубликовано 28 ноября в журнале Клетка. Постдок Массачусетского технологического института Юн Цянь — ведущий автор статьи.

Достижения в области флуоресцентных сигналов

Маркировка молекул внутри клеток флуоресцентными белками позволила исследователям многое узнать о функциях многих клеточных молекул. Этот тип исследования часто проводится с использованием зеленого флуоресцентного белка (GFP), который впервые был использован для визуализации в 1990-х годах. С тех пор для экспериментального использования было разработано несколько флуоресцентных белков, светящихся другими цветами.

Однако типичный световой микроскоп может различать только два или три из этих цветов, что позволяет исследователям лишь крошечное представление об общей активности, происходящей внутри клетки. Если бы они могли отслеживать большее количество меченых молекул, исследователи могли бы, например, измерить реакцию клетки мозга на различные нейротрансмиттеры во время обучения или исследовать сигналы, которые побуждают раковую клетку метастазировать.

«В идеале вы могли бы наблюдать за колебаниями сигналов в клетке в реальном времени, а затем понять, как они связаны друг с другом. Это расскажет вам, как выполняет вычисления клетка», — говорит Бойден. «Проблема в том, что вы не можете смотреть очень много вещей одновременно».

В 2020 году лаборатория Бойдена разработала способ одновременного изображения до пяти различных молекул внутри клетки, направляя светящиеся репортеры в отдельные места внутри клетки. Этот подход, известный как «пространственное мультиплексирование», позволяет исследователям различать сигналы разных молекул, даже если все они флуоресцируют одним и тем же цветом.

В новом исследовании ученые применили другой подход: вместо того, чтобы различать сигналы на основе их физического местоположения, они создали флуоресцентные сигналы, которые меняются со временем. Этот метод основан на «переключаемых флуорофорах» — флуоресцентных белках, которые включаются и выключаются с определенной скоростью. Для этого исследования Бойден и члены его группы определили четыре зеленых переключаемых флуорофора, а затем сконструировали еще два, каждый из которых включается и выключается с разной скоростью. Они также идентифицировали два красных флуоресцентных белка, которые переключаются с разной скоростью, и создали еще один красный флуорофор.

Каждый из этих переключаемых флуорофоров можно использовать для мечения различных типов молекул внутри живой клетки, таких как фермент, сигнальный белок или часть клеточного цитоскелета. После визуализации клетки в течение нескольких минут, часов или даже дней исследователи используют вычислительный алгоритм, чтобы выделить конкретный сигнал от каждого флуорофора, аналогично тому, как человеческое ухо может различать разные частоты звука.

«В симфоническом оркестре есть высокие инструменты, такие как флейта, и низкие инструменты, такие как туба. А посередине находятся такие инструменты, как труба. У всех разные звуки, и наше ухо их различает», — говорит Бойден.

Математический метод, который исследователи использовали для анализа сигналов флуорофора, известен как линейное несмешивание. Этот метод позволяет извлекать различные сигналы флуорофоров, подобно тому, как человеческое ухо использует математическую модель, известную как преобразование Фурье, для извлечения различных тонов из музыкального произведения.

Как только этот анализ будет завершен, исследователи смогут увидеть, когда и где каждая из флуоресцентно-меченых молекул была обнаружена в клетке в течение всего периода визуализации. Саму визуализацию можно сделать с помощью простого светового микроскопа без необходимости специального оборудования.

Исследование биологических явлений

В этом исследовании ученые продемонстрировали свой подход, пометив шесть различных молекул, участвующих в цикле деления клеток млекопитающих. Это позволило им выявить закономерности в том, как уровни ферментов, называемых циклин-зависимыми киназами, изменяются по мере прохождения клетки через клеточный цикл.

Исследователи также показали, что они могут маркировать другие типы киназ, которые участвуют практически во всех аспектах клеточной передачи сигналов, а также клеточные структуры и органеллы, такие как цитоскелет и митохондрии. В дополнение к своим экспериментам с использованием клеток млекопитающих, выращенных в лабораторной чашке, исследователи показали, что этот метод может работать в мозге личинок рыбок данио.

По мнению исследователей, этот метод может быть полезен для наблюдения за тем, как клетки реагируют на любые воздействия, такие как питательные вещества, факторы иммунной системы, гормоны или нейротрансмиттеры. Его также можно использовать для изучения того, как клетки реагируют на изменения в экспрессии генов или генетические мутации. Все эти факторы играют важную роль в таких биологических явлениях, как рост, старение, рак, нейродегенерация и формирование памяти.

«Можно рассматривать все эти явления как общий класс биологических проблем, где какое-то краткосрочное событие — например, употребление питательных веществ, изучение чего-либо или заражение инфекцией — вызывает долгосрочные изменения», — говорит Бойден.

Помимо проведения подобных исследований, лаборатория Бойдена также работает над расширением репертуара переключаемых флуорофоров, чтобы они могли изучать еще больше сигналов внутри клетки. Они также надеются адаптировать систему так, чтобы ее можно было использовать в моделях мышей.

Ссылка: «Временно мультиплексированная визуализация динамических сигнальных сетей в живых клетках», авторы Юн Цянь, Орхан Т. Селикер, Зегуан Ван, Бурку Гунер-Атаман и Эдвард С. Бойден, 28 ноября 2023 г., Клетка.
DOI: 10.1016/j.cell.2023.11.010

Исследование финансировалось стипендией Аланы, К. Лизой Янг, Джоном Дорром, Джедом Маккалебом, Джеймсом Фикелем, Ашаром Азизом, Центром молекулярной терапии К. Лизы Янг и Хока Э. Тана при Массачусетском технологическом институте, Медицинским институтом Говарда Хьюза и тот Национальные институты здоровья.

Исходная ссылка

- Advertisement -

Популярное по теме